Validation of Reference Genes for Quantitative Real-Time PCR in Bovine PBMCs Transformed and Non-transformed by Theileria annulata

Theileria annulata is a tick-borne intracellular protozoan parasite that causes tropical theileriosis, a fatal bovine lymphoproliferative disease. The parasite predominantly invades bovine B lymphocytes and macrophages and induces host cell transformation by a mechanism that is not fully comprehended. Analysis of signaling pathways by quantitative real-time PCR (qPCR) could be a highly efficient means to understand this transformation mechanism. However, accurate analysis of qPCR data relies on selection of appropriate reference genes for normalization, yet few papers on T. annulata contain evidence of reference gene validation. We therefore used the geNorm and NormFinder programs to evaluate the stability of 5 candidate reference genes; 18S rRNA, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), ACTB (β-actin), PRKG1 (protein kinase cGMP-dependent, type I) and TATA box binding protein (TBP). The results showed that 18S rRNA was the reference gene most stably expressed in bovine PBMCs transformed and non-transformed with T. annulata, followed by GAPDH and TBP. While 18S rRNA and GAPDH were the best combination, these 2 genes were chosen as references to study signaling pathways involved in the transformation mechanism of T. annulata.

Avaliação do papel das células T CD8+ e análise proteômica nas Biópsias de pacientes com Leishmaniose Cutânea Localizada infectados por L. braziliensis / Assessing the role of CD8 + T cells and proteomic analysis in biopsies from patients with cutaneous leishmaniasis infected by L. braziliensis Located

Células T CD8+ são essenCIaIS na defesa contra vírus, mas pouco se sabe sobre a sua participação na defesa do hospedeiro contra parasitas, como a Leishmania. Nesse trabalho, investigou-se a participação das células T CD8+ no processo inflamatório e na indução da morte do parasita, bem como os perfis proteômicos das lesões dos pacientes com leishmaniose cutânea localizada (LCL) infectados por L. braziliensis. Observa-se uma alta porcentagem de células T CD8+ nas lesões dos pacientes com LCL, como sugerido pela maior frequência de células T CD8+CD45RO+ e células T CD8+CLA + em comparação com CMSP do próprio indivíduo. Após re-estimulação com L. braziliensis, a maioria das células T CD8+ presentes na lesão expressam marcadores citolíticos, CD 107a e Granzima B. Além disso, a co-cultura de macrófagos infectados com linfócitos T CD8+ resultou na libertação de granzima B. A utilização do inibidor da granzima B, assim como Z-V AO, Fas:Fc ou anti­ IFN-y não teve nenhum efeito sobre a morte do parasita. Por outro lado, a co-cultura de macrófagos infectados com células T CD4+ diminuiu a taxa de infecção, efeito que foi completamente revertido ao se utilizar o anti-IFN-y, enfatizando o papel determinante de células T CD4+IFN-/ na morte da Leishmania. Além disso, observou-se um total de 150 proteínas diferencialmente expressas entre as lesões de pacientes com LCL e as amostras de pele normal. Destas, cinquenta e nove proteínas foram identificadas. Entre elas, 13 apresentaram uma maior ou menor expressão nas amostras dos pacientes em relação a pele normal. Vinte e sete proteínas foram encontradas somente nas lesões dos pacientes e 18 somente nas amostras de pele normal. Essas proteínas foram associadas com processos de regulação biológica; incluindo apoptose, ciclo celular e resposta imune. Para explorar as interações entre as proteínas identificadas e as proteínas e os genes que poderiam ser afetados por elas, redes e sub-redes de interações foram geradas. Após análises de imuno-histoquímica, a presença de caspas e 9, caspase-3 e granzima B foi validada no sítio da lesão. A expressão da granzima B nas lesões dos pacientes correlacionou-se positivamente com a expressão da caspase 9 e a porcentagem de células positivas para TUNEL. Observou-se também uma maior porcentagem de células postivas para TUNEL expressando granzima B nas biópsias dos pacientes que apresentam um processo mais intenso de necrose. Além disso, a presença de granzime B, caspase 9 e caspase-3 foram correlacionados positivamente com o tamanho da, lesão. Neste estudo, podemos concluir que as células T CD8+Granzima B+ estão envolvidas na patogênese da L. braziliensis, através da ativação da apoptose no sítio inflamatório, favorecendo a progressão do dano tecidual observado nos pacientes com LCL

Modificaçöes nucleares em células parasitadas pelo Trypanosoma cruzi em chagásicos crônicos / Nuclear modifications in cells parasited by Trypanosoma cruzi in chronic chagasic patients

Através do estudo da musculatura-lisa da parede da veia central das supra-renais de chagásicos crônicos foram identificados núcleos em 18 dentre 40 células parasitadas pelo Trypanosoma cruzi. Com o auxílio de uma ocular micrométrica foram tomados dois diâmetros de cada ninho e núcleo, obtendo-se suas médias e desvios padröes (25,7) micronm ñ 17,2 e 12 micronm ñ 5,3 e 7,5 micronm ñ 2,82 para diâmetro dos ninhos e dos núcleos para células mononucleadas e binucleadas respectivamente). A relaçäo diâmetro do núcleo/diâmetro do ninho foi de 0,5 ñ 0,16. 83,3% do ninhos eram mononucleados e apenas 16,7% binucleados. A média do volume nuclear para as células parasitadas foi de 1204 micronm**3 ñ 807,0 e para as células musculares lisas näo parasitadas foi de 69,6 micronm ñ 7,2. A forma e o contorno nucleares eram variados e irregulares. Os núcleos hipercromáticos ou vesiculosos, com membrana cromatínica geralmente espessa e bem definida, frequentemente mostrando um a dois nucléolos por secçäo, podendo, no entanto, serem encontrados até 8 nucleólos. Sendo as alteraçöes nucleares descritas freqüentes nos chagásicos crônicos, é possível que sejam a expressäo morfológica de importantes interaçöes entre o T. cruzi e o leimiócito